• Валидация Методик Анализа Лекарственных Средств
• Руководство По Валидации Методик Анализа Лекарственных Средств

По валидации методик анализа лекарственных средств. (методические рекомендации). Под редакцией: Н.В.Юргеля, А.Л.Младенцева. Методы разделения 6. Определение воды полумикрометодом. Рекомендации относительно критериев при проведении валидации для методик количественного анализа 32. Требования к неопределенности результатов анализа. Лекарственных средств. Валидации методики ее. Методики анализа.

Обзор требований к валидации биоаналитических методик Дана оценка требований к валидации биоаналитических методик в соответствии с документами U.S. FDA и Европейского Медицинского Агентства (EMA). Введение В документах U.S. FDA и EMA биоаналитической методикой называется методика количественного определения лекарственных веществ (ЛВ) и (или) их метаболитов в биологических объектах (цельной крови, плазме, сыворотке, моче и др.) человека и животных 1,2. Биоаналитические методики используются в основном при проведении фармакокинетических исследований (в т.ч. Исследований биоэквивалентности), токсикокинетических исследований, изучении метаболизма. Основные методы анализа, применяемые для определения ЛВ и их метаболитов в биологических жидкостях, преимущественно относятся к хроматографическим (ВЭЖХ, ГЖХ, ВЭЖХ-МС, ВЭЖХ-МС-МС, ГХ-МС, ГХ-МС-МС), а также к иммунологическим (например, твердофазный иммуноферментный анализ или поляризационно-флуоресцентный иммуноанализ) и микробиологическим 1,2.

Объем валидации для фармакопейных и нефармакопейных методик испытаний. Особенности валидации микробиологических методов контроля качества (микробиологической чистоты и стерильности). Методика определения качества лекарственных средств по микробиологическим показателям считывается валидной, если для трех различных серий препарата, на трех разных партиях питательных сред, у трех разных специалистов пригодность методики была подтверждена. Пригодность методики испытания: 1. Использование фармакопейных тест- микроорганизмов и подготовка их в соответствии с фармакопейными требованиями. РУКОВОДСТВО по валидации методик анализа лекарственных средств.

Согласно рекомендациям ICH 3,4 биоаналитическая методика, как и любая аналитическая методика, должна быть подвергнута валидации. При этом следует отметить, что требования к валидации фармакопейных аналитических и биоаналитических методик различаются 5. Это, в первую очередь, связано с большей вариабельностью результатов биоаналитических определений (поскольку такие методики могут включать в себя процессы экстракции, осаждения белков и др.), а также со сложным составом биологической матрицы, содержащей определяемое вещество 6. Особенности валидации биоаналитических методик В настоящее время существуют два основных руководства по валидации биоаналитических методик – руководство для предприятий U.S. 1 и драфт-руководство Европейского Медицинского Агентства (ЕМА) 2009 г.

В Российской Федерации нормативные документы, регламентирующие процедуру подобной валидации, отсутствуют, а данные вопросы затрагиваются в научных публикациях. Валидация биоаналитической методики может быть полной, частичной либо кросс-валидацией. Полную валидацию проводят при разработке новой биоаналитической методики. Частичную валидацию проводят при смене лаборатории, оборудования, условий хранения проб и т.д. Для проведения частичной валидации обычно бывает достаточно провести определение правильности и прецизионности на уровнях intra-day (between-run) и, если применимо, определение стабильности.

Валидация Методик Анализа Лекарственных Средств

Кросс-валидацию проводят при необходимости сравнения результатов определений, полученных из разных лабораторий. При этом результаты анализа определяемого вещества с помощью обеих методик не должны различаться более чем на 15% 1,2. Валидационные характеристики биоаналитической методики. Специфичность/селективность (selectivity) Специфичность – это способность методики безусловно определять действующее вещество в присутствии компонентов, которые могут содержаться в пробе 7.

Для определения специфичности методики проводят анализ не менее 6 образцов чистой биологической жидкости. Параллельно проводят анализ чистой биологической жидкости, к которой предварительно прибавляют стандартный раствор определяемого вещества или веществ (и внутреннего стандарта, если это применимо) в таком количестве, чтобы его содержание в пробе находилось в предполагаемом диапазоне концентраций фармакокинетической кривой. Также анализируют стандартный раствор определяемого вещества и при необходимости – внутреннего стандарта. На всех хроматограммах образцов чистой биологической жидкости не должно наблюдаться пиков со временем удерживания, соответствующим времени удерживания определяемого вещества и внутреннего стандарта, которое определяют по хроматограммам стандартного раствора. Руководство ЕМА уточняет, что максимально допустимое мешающее воздействие посторонних веществ с временами удерживания определяемого вещества (и внутреннего стандарта, если это применимо) не должно превышать 20% от предела количественного определения (ПКО) определяемого вещества. В противном случае необходимо изменение условий методики определения 1,2. Линейность/калибровочная кривая (calibration curve) Линейность – это способность методики (в пределах определенного диапазона) получать результаты, прямо пропорциональные концентрации (количеству) действующего вещества в пробе 7.

Для определения линейности проводят анализ не менее 6 образцов (обычно 6-8) чистой биологической жидкости, к каждому из которых предварительно прибавляют стандартный раствор определяемого вещества (и внутреннего стандарта, если это применимо) в таком количестве, чтобы содержание определяемого вещества в полученных растворах соответствовало предполагаемому диапазону концентраций фармакокинетической кривой (калибровочные образцы), причем данный диапазон должен включать в себя предполагаемый ПКО. Кроме того, проводят анализ пробы чистой биологической жидкости, к которой не прибавляют ЛС (холостая проба), и чистой биологической жидкости с прибавлением внутреннего стандарта (нулевая проба). При построении калибровочной кривой используют пригодные статистические методы (например, регрессионный анализ), причем нулевая точка в расчет не принимается. Для оценки приемлемости линейности в уравнение калибровочной кривой подставляют средние значения площадей пиков калибровочных образцов и рассчитывают отклонения полученных значений концентраций от фактических. Величина относительной погрешности рассчитанных концентраций от фактических для точки, соответствующей ПКО, не должна превышать 20%, для остальных точек – 15%, причем данное условие должно соблюдаться не менее чем для 4 образцов из 6 (FDA) 1 либо не менее чем для 75% образцов, но не менее 6 (ЕМА). 2 В случае, если несколько (в рамках вышеуказанных условий) калибровочных стандартов не соответствуют критерию приемлемости, то необходимо повторно рассчитать уравнение калибровочной кривой, при этом выпадающие результаты не учитывают. Прецизионность и правильность (precision and accuracy) Прецизионность и правильность методики определения лекарственного вещества в биологической жидкости определяют на двух уровнях – в течение 1 рабочего дня (inter-day accuracy и inter-day precision) и в течение нескольких (не менее 2) рабочих дней (intra-day accuracy и intra-day precision) 1,2.

При использовании хроматографа с автосамплером (ЕМА) допустимо проводить определение прецизионности и правильности в пределах одной хроматографической последовательности (within-run accuracy и within-run precision) и между хроматографическими последовательностями (between-run accuracy и between-run precision) 2. Прецизионность и правильность методики определяют на одних и тех же пробах. Для этого проводят анализ не менее 3 (FDA) или 4 (EMA) образцов чистой биологической жидкости, к каждому из которых предварительно прибавляют стандартный раствор определяемого вещества и внутреннего стандарта при необходимости в таком количестве, чтобы содержание определяемого вещества в полученных растворах находились на нижней границе (ПКО), верхней границе (75% от верхней точки линейного диапазона) и середине (50%) линейного диапазона методики 1,2. ЕМА дополнительно рекомендует анализировать точку, соответствующую 3-кратному значению ПКО 2. Каждую пробу хроматографируют не менее 5 раз и рассчитывают по калибровочной кривой концентрации определяемого вещества в биологической жидкости.

Прецизионность и правильность методики характеризуют величины относительного стандартного отклонения и относительной погрешности, соответственно. Данные значения не должны превышать 20% для точки, соответствующей ПКО, и 15% - для остальных точек на уровнях inter-day (within-run) и intra-day (between-run) 1,2. Кроме того, руководство FDA совместно с прецизионностью и правильностью рекомендует определять степень извлечения (recovery), которая представляет собой отношение отклика детектора пробы биологической жидкости с прибавленным раствором определяемого вещества и раствора этого вещества такой же концентрации.

При этом критерий приемлемости степени извлечения не нормируется 1. В то же время очевидно, если методика обладает приемлемой правильностью и прецизионностью, это подразумевает, что степень извлечения соответствует допустимым нормам и ее определение не требуется. Предел количественного определения (lower limit of quantification, upper limit of quantification) Оба нормативных документа (FDA и EMA) выделяют два предела количественного определения – нижний ПКО (LLOQ) и верхний ПКО (ULOQ). Нижнему пределу количественного определения соответствует минимальная концентрация определяемого вещества в биологической жидкости, для которой величины относительного стандартного отклонения и относительной погрешности не превышают 20% на уровнях inter-day (within-run) и intra-day (between-run). FDA дополнительно уточняет, что отношение сигнал-шум для ПКО должно составлять не менее 5. Верхнему пределу количественного определения соответствует верхняя точка линейного диапазона калибровочной кривой 1,2.

Стабильность (stability) Определение стабильности проводят с целью подтверждения, что ни один из этапов анализа, включая хранение образцов, не влияет на концентрацию определяемого вещества в пробе. При полной валидации биоаналитической методики рекомендуется проводить следующие испытания на стабильность 1,2: - стабильность исходного и рабочих растворов стандартного вещества и внутреннего стандарта (stock solution stability); - стабильность определяемого вещества в биологической жидкости после заморозки и разморозки (freeze and thaw stability). Данную характеристику определяют после, по крайней мере, 3 циклов заморозки и разморозки; - длительная стабильность определяемого вещества в биологической жидкости при хранении в морозильнике (long term stability).

Данную характеристику определяют в течение периода времени, соответствующего длительности одного исследования; - кратковременная стабильность определяемого вещества в биологической жидкости и пробах (экстракте и т.д.) при комнатной температуре (short term stability). Данную характеристику определяют в течение 4 - 24 часов; - стабильность приготовленных проб, в т.ч.

При хранении в автосамплере (post-preparative stability). Данную характеристику определяют в течение периода, соответствующего времени хранения хроматографической последовательности в автосамплере.

Стабильность исходного и рабочих растворов стандартного вещества и внутреннего стандарта определяют после соответствующего разведения до концентрации, соответствующей диапазону линейности детектора. Для определения других видов стабильности проводят анализ не менее 3 проб (растворов) чистой биологической жидкости, к каждому из которых предварительно прибавляют стандартный раствор определяемого вещества (и внутреннего стандарта, если это применимо) на двух уровнях концентраций, соответствующих нижней и верхней части калибровочной кривой. Стабильность считается подтвержденной, если величина относительной погрешности рассчитанных значений концентраций от фактических не превышает 15% 1,2. Анализ исследуемых образцов Анализ исследуемых образцов допустимо проводить только после проведения валидации используемой методики.

Опубликовано вБерезина Е.С. 1, Голованенко А.Л. 2, Алексеева И.В. 3 1Доцент, кандидат фармацевтических наук, 2Доцент, кандидат фармацевтических наук, 3Доцент, доктор фармацевтических наук, Пермская государственная фармацевтическая академия ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЛОРГЕКСИДИНА БИГЛЮКОНАТА В ГЕЛЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ КАРИЕСА ДЕНТИНА Аннотация В статье представлены результаты валидации методики количественного определения хлоргексидина биглюконата в геле для лечения кариеса дентина. Для количественного определения хлоргексидина биглюконата предложен лаурилсульфатный метод по варианту осадительного титрования. Методика оценивалась по валидационным характеристикам: аналитическая область применения, линейность, правильность и прецизионность (сходимость). В результате проведенных исследований установлено, что аналитическая область применения, предложенной методики от 80 до 120%, подтверждена линейная зависимость расхода титранта от количественного содержания хлоргексидина биглюконата, средний процент регенерации 99,2%.

Валидируемая методика позволяет определить количественное содержание хлоргексидина биглюконата в присутствии сопутствующих компонентов и может быть рекомендована для включения в нормативную документацию. Ключевые слова: валидация, хлоргексидина биглюконат, лаурилсульфатный метод. Berezina E.S. 1, Golovanenco A.L. 2, Alekseeva I.V. 3 1Associate professor, PhD in Pharmaceutics, 2Associate professor, PhD in Pharmaceutics, 3Associate professor, PhD in Pharmaceutics, Perm State Pharmaceutical Academy VALIDATION OF QUANTITATIVE DETERMINATION METHOD OF CHLOROXEXIDINE BIGLUCONATE IN GEL FOR DENTINE CARIES TREATMENT Abstract The paper presents the results of validation method for quantitative determination of chlorhexidine bigluconate in gel for dentine caries treatment.

Lauryl-sulfate method was proposed as a means of quantitative determination of chlorhexidine bigluconate according to precipitation titration variant. The method was evaluated by validation characteristics: Analytical field of application, linearity, accuracy and precision (convergence). As a result of the conducted studies, it was found that analytical range of application of the proposed method from 80 to 120% confirmed the linear dependence of titrant consumption on the quantitative content of chlorhexidine bigluconate, the average regeneration rate comprised 99.2%. The validated procedure allows determining quantitative content of chlorhexidine bigluconate in the presence of concomitant components and can be recommended for inclusion in regulatory documentation. Keywords: validation, chlorhexidine bigluconate, lauryl-sulfate method.

Кариес зубов в настоящее время является наиболее распространенным заболеванием человечества. Поэтому в последние годы особую актуальность приобретает реминерализующая терапия – лечебно-восстановительная методика поступления и проникновения в твердые ткани зуба фтора, кальция, фосфора и др., в результате чего происходит укрепление дентина и зубной эмали, что повышает устойчивость к кариозным поражениям. Несмотря на большое количество разработанных к настоящему времени препаратов, методик их применения, поиск и апробация новых средств для проведения реминерализующей терапии не теряют свою актуальность и востребованность в практическом здравоохранении. Одним из путей решения данной проблемы является разработка лекарственных форм на основе полимеров. В результате комплекса проведенных научно – экспериментальных исследований предложен медикаментозный способ лечения среднего и глубокого кариеса реминерализующим гелем. В геле одновременно содержатся основные реминерализующие ионы – кальция, фосфора и фтора. Благодаря структурированным водным пространствам в геле обеспечивается защитный эффект относительно взаимодействия Са 2+, НРО 4 2- и F –, что позволяет сохранить минерализующие компоненты в свободном активном состоянии и тем самым обеспечить существенное повышение их проникновения в дентин; моделирование осуществляется по кальциевофосфорному коэффициенту дентина 2:1.

Для подавления кариесогенной микрофлоры в кариозной полости в состав геля для реминерализации дентина введен антисептик хлоргексидина биглюконат, эффективный в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, оказывающий фунгицидное действие на грибы 1, С. Необходимым условием внедрения лекарственного препарата в медицинскую практику является стандартизация, предусматривающая разработку нормативной документации, регламентирующей показатели качества, требования к ним и методики их определения.

Документированным подтверждением обоснованности выбора метода испытания для определения показателей и норм качества лекарственных средств является валидация, главной задачей, которой является экспериментальное доказательство того, что данная методика пригодна для достижения тех целей, для которых она предназначена 2, С. Валидация аналитической методики позволяет своевременно выявить недостатки методики, улучшить качество, повысить точность результата 3, С.

Целью исследования являлась валидация методики количественного определения хлоргексидина биглюконата в геле для лечения кариеса дентина лаурилсульфатным методом по варианту осадительного титрования. Метод основан на образовании трудно растворимых лаурилсульфатов органических соединений, содержащих основный атом азота и имеющих величину молекулярной массы более 200 4, С.50. Методика оценивалась по следующим валидационным характеристикам: аналитическая область применения, линейность, правильность и прецизионность (сходимость) 2, С. Неорганические соли, входящие в состав геля, не реагируют с титрантом и не влияют на результаты анализа, что было подтверждено экспериментально. При апробации методики параллельно были приготовлены модельные смеси без хлоргексидина биглюконата, при титровании которых изменение окраски индикатора не происходило. Поэтому метод можно рассматривать как специфичный для хлоргексидина биглюконата.

Валидационные характеристики методики изучали на десяти лабораторных сериях геля, для каждой серии проведено не менее трех определений, для статической обработки взяты средние результаты. Для изучения аналитической области применения, линейности, правильности методики, были приготовлены модельные смеси с содержанием хлоргексидина биглюконата 80%, 90%, 100%, 110%, 120% от количества, заявленного в составе геля.

2,0 г геля растворяют в 50 мл воды очищенной, прибавляют 3 мл уксусной кислоты разведенной 30% (раствор должен быть прозрачным), 5 кап. Спиртового раствора бромфенолового синего 0,1% и титруют раствором лаурилсульфата натрия (натрия додецилсульфата) 0,005 М до перехода окраски от зеленой через сине-зеленую до светло зеленой. 1 мл 0,005М раствора лаурилсульфата натрия (натрия додецилсульфата) соответствует 0,002243 г хлоргексидина биглюконата. Содержание хлоргексидина биглюконата (ХГБ) в геле для лечения кариеса дентина рассчитывали по формуле: Х= ТVКР/а, где Х – содержание ХГБ в геле, г; Т – титр 0,005 М лаурилсульфата натрия по ХГБ, г/мл; Р – масса геля, г; V – объем титрованного раствора, израсходованного на титрование, мл; К – коэффициент поправки к молярности титранта; а – навеска геля, г. При статистической обработке полученных данных установлено: относительная ошибка среднего результата составляет 0,91%, доверительный интервал 0,100г ±0,001г, стандартное отклонение результата отдельного определения 0,00128г или 1,28%. Полученные данные свидетельствуют об удовлетворительном уровне прецизионности (сходимости) валидируемой методики 5, С.

Результаты анализа модельных смесей подтверждают линейную зависимость расхода титранта ( у) от количества хлоргексидина биглюконата ( х) в образце (рис. 1 – График зависимости объема титрованного раствора от количества хлоргексидина биглюконата в геле При обработке данных было выведено следующее уравнение зависимости: у = 8,8975 х + 0,0015 Коэффициент корреляции R = 1, что свидетельствует о линейной связи между переменными х. 8,8975 – угловой коэффициент ( в); 0,0015 – свободный член ( а). Полученные результаты свидетельствуют о том, что аналитическая область использования валидируемой методики находится в интервале от 80% до 120% содержания хлоргексидина биглюконата в геле для лечения кариеса дентина (от номинального по составу) 5, С.

Для оценки правильности методики по результатам анализа модельных смесей рассчитан процент регенерации хлоргексидина биглюконата (табл. Таблица 1 – Оценка правильности методики Количество хлоргексидина биглюконата Регенерация,% От заявленного в геле (по составу),% В модельной смеси, г Найдено, г 80 0,080 0,074 93 90 0,090 0,086 96 100 0,100 0,100 100 110 0,110 0,114 104 120 0,120 0,124 103 Полученные данные находятся в интервале от 93% до 103%, средний процент регенерации составляет 99,2%, что свидетельствует об удовлетворительной правильности валидируемой методики. Драйвер для принтера sharp ar-5320. В результате проведенных исследований установлено, что методика определения хлоргексидина биглюконата в геле для лечения кариеса дентина лаурилсульфатным методом имеет удовлетворительную прецизионность (сходимость), аналитическая область применения от 80 до 120%, подтверждена линейная зависимость расхода титранта от количественного содержания хлоргексидина биглюконата, коэффициент корреляции R = 1, средний процент регенерации составляет 99,2%, что свидетельствует об удовлетворительной правильности. Валидируемая методика специфична, позволяет определить количественное содержание хлоргексидина биглюконата в присутствии сопутствующих компонентов, и может быть использована при постадийном контроле в процессе производства и контроле качества конечного продукта.

Предлагаемая методика может быть рекомендована для включения в нормативную документацию. Список литературы / References. Леонова Л.Е. Эффективность лечения кариеса дентина с использованием лекарственных средств реминерализующего действия / Л.Е. Леонова, Г.А.

Павлова, Р.Г. Першина и др. // Пермский медицинский журнал. ОФС 1.1.0012.15 Валидация аналитических методик. Государственная фармакопея Российской Федерации.

I, – М., –2015. – С.222 – 234. (Федеральная электронная медицинская библиотека) Электронный ресурс. – URL: (дата обращения: ).

Юргель Н.В. Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств: Методические рекомендации / Н.В. – М.: Издательство «Спорт и Культура – 2000», 2007. Чекрышкина Л.А. Анализ растворов хлоргексидина биглюконата в условиях аптеки / Л.А.

Чекрышкина, Н.И. Березина и др. // Новая аптека. Эффективное управление. ОФС.1.1.0013.15 Статистическая обработка результатов химического эксперимента. Государственная фармакопея Российской Федерации.

I, – М., – 2015. – С.235 – 264. (Федеральная электронная медицинская библиотека) Электронный ресурс. – URL: (дата обращения: ). Список литературы на английском языке / References in English. Leonova L.E.

Effektivnost lecheniya kariesa dentina s ispolzovaniem lekarstvennykh sredstv remineraliziruyeschego deystviya Efficiency of dentine Caries Treatment with the Help of Remineralizing Drugs / L.E. Leonova, G.A. Pavlova, R.G.

Pershina, etc. // Permskiy meditsinskiy zhurnal Perm Medical Journal – 2016. In Russian.

Руководство По Валидации Методик Анализа Лекарственных Средств

OFS 1.1.0012.15 Validatsiya analiticheskikh metodik. Gosudarstvennaya farmakopeya Rossiyskoy Federatsii General Monograph 1.1.0012.15 Validation of Analytical Techniques.

State Pharmacopoeia of the Russian Federation XIII ed. I, – M., -2015. – P.222 – 234. (Federal electronic medical library) Electronic resource. – URL: (accessed date: ).

In Russian. Yurgel N.V. Rukovodstvo po validatsii metodik analiza lekarstvennykh sredstv: Metodicheskiye rekomendatsii Guidance on the Validation of Drug Analysis Techniques: Methodological Recommendations / N.V. – M.: Publishing House “Sport and Culture – 2000,” 2007. In Russian. Chekryshkina L.A. Analiz rastvorov khlorgeksidina bigliukononata v usloviyakh apteki Analysis of Chlorhexidine Bigluconate Solutions in the Condition sof a Pharmacy / L.A.

Chekryshkina, N.I. Berezina and others // Novava apteka. Effektivnoye upravleniye New pharmacy. Effective management – 2009. In Russian. 1.1.0013.15 Statisticheskaya obrabotka rezultatov khimicheskogo eksperimenta. Gosudarstvennaya farmakepeya Rossipeyskoy Federatsii General Monograph.1.1.0013.15 Statistical Processing of the Results of a Chemical Experiment.

State Pharmacopoeia of the Russian Federation XIII ed. I, – М., – 2015. – P.235 – 264. (Federal electronic medical library) Electronic resource. – URL: (accessed date: ). In Russian.